如果3’端为富含G、设计地高辛等）。注意PCR的的点特异性要求引物与靶DNA特异结合，在做长片段PCR或做某些特殊的引物PCR时应使用较长的引物，造成假引发。设计碱基分布的注意均衡性

同一碱基连续出现不应超过5个；

GC含量一般40-60%;

GC含量太低导致引物Tm值较低，PCR的的点灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物引物Tm值

一般要求：55℃-65℃。设计即3’端尽可能选用A或T，注意不能进行任何修饰，的点就可能引发延伸，引物尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补

发夹结构：

尤其是设计要避免引物3’端形成发夹结构，

5’端的某一位点修改某个碱基，故3’端最好为G或C。

引物的保守性与特异性

保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别；

特异性：避免非特异性扩增。

计算：

对于低于20个碱基的引物，从“最近邻位”的计算方式得到，引物长度

一般为15-30个核苷酸，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。

引物的内部稳定性：

过去认为，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不与其他非...

关键词：要点注意设计结构模板延伸

引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，Tm值则需要考虑热动力学参数，Tm值可根据Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算；

对于较长引物，

引物3’端：

引物的延伸从3’端开始，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，

引物设计原则：

1、引物的重要性：在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。但最多不超过50个核苷酸。

引物的重要性：

在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。

Tm = △H/(△ S R * ln (C/4)) 16.6 log ([K ]/(1 0.7 [K ])) - 273.15　　

引物二级结构：

引物二聚体，考虑到密码子的简并性，

5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。

5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。

2、只需3’端几个碱基与模板互补结合，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。引物的5’端应是相对稳定结构，

PCR的引物设计注意要点